RESUMEN
Las vastas aplicaciones e implicaciones (científicas, tecnológicas, éticas, etc.) de la genética y de las tecnologías “ómicas” relacionadas a ella (genómica, proteínica, transcriptómica, etc.) han empezado a emerger con un empuje imparable en la primera década del siglo XXI.
Las pruebas de diagnóstico molecular con aplicación al diagnóstico clínico implican estudios en enfermedades infecciosas, enfermedades hereditarias, la oncología, la predisposición a la enfermedad o la descripción de los polimorfismos como marcadores de estados de enfermedad. Estos recientes avances tecnológicos han impulsado al laboratorio de microbiología hacia la prevención y el control de las infecciones por medio de las herramientas moleculares. La rápida adaptación de las tecnologías moleculares al campo de la microbiología clínica ahora influye enormemente en el manejo de las enfermedades infecciosas y prácticas de control de la infección.
DESARROLLO
Las pruebas de diagnóstico molecular abarcan una amplia gama de detección de enfermedades infecciosas, pruebas genéticas para detectar enfermedades hereditarias y pruebas para medir predisposición a enfermedades o tamizado de polimorfismos relacionados con la enfermedad.
Se le denomina pruebas moleculares debido a que implican la detección de bio-moléculas, tales como los ácidos nucleicos (ADN o ARN), anticuerpos o proteínas. En el campo de la oncología, se han utilizado pruebas de ADN para para diferentes tipos de cáncer (colon, mama, pulmón, etc.). Pero sin lugar a duda, el área que ha sido impactada con más fuerza ha sido la microbiología, donde se han utilizado ensayos moleculares para diagnóstico de enfermedades infecciosas (bacterianas y fúngicas).
Empleando ADN o ARN como moléculas blanco de detección y caracterización, se han diseñado pruebas tanto cualitativas como cuantitativas de ácidos nucleicos para la confirmación de la infección por virus, por ejemplo, para donaciones de sangre, y se han utilizado pruebas genéticas para enfermedades hereditarias que puedan facilitar algún tipo de infección o incrementar el riesgo (susceptibilidad a enfermedades debida a ciertos haplotipos poblacionales asociados a la molécula de HLA).
El objetivo de todo proceso de diagnóstico médico es la determinación de la causa de una enfermedad. Frecuentemente el desarrollo de una nueva estrategia diagnóstica es en sí misma una línea de investigación básica en la cual está implicada la caracterización de un gen y el espectro de mutaciones que estén involucradas o que causan la patología en estudio.
El diagnóstico molecular de infecciones no escapa a los postulados de Koch y debe de demostrarse, en este caso, en primer lugar, la presencia del material genético del o de los patógenos implicados en cada caso donde se presente la infección. No obstante, las pruebas de diagnóstico molecular requieren, al igual que el resto de las pruebas diagnósticas más convencionales, de procedimientos analíticos y evaluaciones clínicas para su aprobación como un ensayo diagnóstico, capaz de discriminar verdaderos positivos o negativos y presentar valores altos de sensibilidad y especificidad.
En las pruebas de diagnóstico molecular es deseable tener resultados de cualquiera de los siguientes tipos: continuo, ordinal o nominal. En los resultados de tipo continuo u ordinal se busca la dicotomía para dar solamente dos respuestas o salidas: positivo o negativo, que también puede interpretarse cualitativamente como la presencia o ausencia de un objetivo o condición de interés.
En otras ocasiones se busca una respuesta numérica o cuantitativa, donde no sólo interesa la ausencia o presencia sino también su cantidad, tal como ocurre en las denominadas cargas virales, como por ejemplo para Hepatitis C (HCV) y Virus de Inmuno Deficiencia Humana (VIH).
De esta manera podemos concluir que las pruebas basadas en biología molecular y que van dirigidas a la detección de ácidos nucleicos, son, sin duda alguna, las más poderosas herramientas diagnósticas con las cuales cuenta la medicina en la actualidad.
Debido a que el diagnóstico molecular implica técnicas para analizar biomarcadores en el código genético de los organismos (genoma), y cómo las células expresan sus genes (transcriptoma) en forma de proteínas (proteomas); estas técnicas aplican fundamentos de la biología molecular para permitir diagnosticar individuos sintomáticos, asintomáticos, vigilar la evolución de la enfermedad, proporcionar pronóstico en pacientes enfermos, detectar riesgo y seleccionar pacientes para terapias específicas.
Las pruebas de diagnóstico molecular utilizan ensayos que detectan una bio-molécula, a menudo en bajas concentraciones, utilizando diferentes tecnologías.
Estas tecnologías pueden agruparse en las siguientes categorías:
(1) amplificación del bio-marcador (ADN, ARN)
(2) secuencia del biomarcador
(3) amplificación de señal
(4) métodos de no amplificación (proteínas).
En este artículo nos centraremos en la primera categoría.
Amplificación de bio-marcadores: Muchos ensayos moleculares utilizados en el laboratorio clínico se basan en la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa o PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction) de ADN o ARN (retro transcripción acoplada a PCR) del patógeno u organismo de interés.
La PCR puede realizarse directamente a partir de especímenes de pacientes o, alternativamente, de organismos aislados. El propósito de la PCR es amplificar el ácido nucleico de interés a un límite detectable. En su formato más básico, esta reacción in vitro utiliza un conjunto de reactivos y una enzima polimerasa termoestable para sintetizar millones de copias del ácido nucleico objetivo, también conocidos como amplicones o fragmentos de amplificación, por medio de un proceso de ciclado térmico, por lo que una hebra del ADN se duplica varias veces por cada ciclo repetido.
La versión más reciente de la PCR se denomina Real-timePCR, o PCR en tiempo real. Ha revolucionado la detección directa de patógenos al incorporar el uso de fluorocromos e iniciadores (primers) en la reacción de amplificación y utiliza la óptica para monitorizar la emisión de fluorescencia al final de cada ciclo.
La inclusión de software que examina e interpreta la cinética de reacción en tiempo real y genera una gráfica de amplificación para la reacción acelera el proceso de detección de objetivos de manera significativa. Usando múltiples fluorocromos, la PCR en tiempo real puede convertirse en un sistema multiplexado, por lo tanto, puede realizar la detección de varios objetivos en un mismo ensayo, ya sean estos diferentes patógenos o bien de diferentes mutaciones que confieran resistencia a fármacos.
Las ventajas generales de la PCR múltiplex incluyen la capacidad de detectar un número de patógenos alto (hasta la fecha un máximo de 15 por reacción) y que proporcionan igual sensibilidad que si de ensayos individuales se tratara.
Otra ventaja es que, a diferencia del cultivo, que requiere de 48 horas a 6 semanas para el crecimiento de hongos o por ejemplo de Mycobacterium tuberculosis (MTB), pueden proporcionar resultados en unas pocas horas.
Es importante hacer notar, sin embargo, que la amplificación del ADN no depende de la viabilidad del organismo; a pesar de que esto podría ser una ventaja en algunas situaciones, los resultados positivos de PCR deben interpretarse con precaución porque un patógeno no viable puede no estar contribuyendo a la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, la PCR puede ser adecuada para el seguimiento de las infecciones tratadas o pruebas de cura con sus respectivas pruebas complementarias.
Anteriormente, las pruebas moleculares requerían múltiples químicas complejas y eran más adecuadas para ser realizadas en un laboratorio molecular de investigación por personal capacitado. La compleja naturaleza de las versiones anteriores de los ensayos moleculares tenía la desventaja de la posible contaminación cruzada que puede conducir a falsos positivos.
Varios avances en tecnología, incluyendo la automatización y la nanotecnología, han simplificado las complejidades inherentes a las metodologías anteriores. De hecho, muchos ensayos desarrollados recientemente requieren muy poco tiempo de ejecución e incorporan amplificación, extracción y la detección en un solo módulo o bien de ejecución automatizada por medio de un robot.
Con la PCR en tiempo real, donde la amplificación y la detección se realizan dentro de un mismo recipiente de reacción cerrado, hay menos manipulación de reactivos y, consecuentemente, reduce las oportunidades de liberación de ADN amplificado en el medio ambiente.
Con el advenimiento de las nuevas tecnologías, nos incumbe determinar la utilidad clínica y rentabilidad de estas técnicas, y educar a las partes interesadas sobre el uso interpretación de los resultados para una mejor atención al paciente.
Además, necesitamos permanecer a la vanguardia de la tecnología y entender los beneficios y las deficiencias para seguir mejorando el diagnóstico y control de enfermedades infecciosas.
CONCLUSIONES
El mundo de la microbiología ha cambiado dramáticamente en los últimos 40 años. Ahora sabemos de interacciones entre microbiomas y el complejo equilibrio que dispara las enfermedades infecciosas. La Biología Molecular ha contribuido significativamente a validar los postulados de Koch, logrando ir más allá de la mera fenotipificación de los organismos patógenos.
Ahora podemos identificar y caracterizar con precisión los patógenos emergentes, re-emergentes, o localizar la fuente de los brotes en cuestión de días o incluso de horas, para algunas de las enfermedades infecciosas de interés en salud pública.
Con las nuevas tecnologías aplicadas a la microbiología se abre un nuevo camino de personalización de la medicina y utilización mejorada del laboratorio, así como nuevas responsabilidades para laboratorios y médicos en la prevención de infecciones.
Fuente:
López Orduña, E. (2022). APLICACIONES DE BIOLOGÍA MOLECULAR AL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS: qPCR, DEL LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN A LA CAMA DEL PACIENTE. Horizontes del Conocimiento, 153(1), https://www.aesculapseguridaddelpaciente.org.mx/docs/revista/2022/Nov2022.pdf
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